造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）拥有自我更新能力和多谱系分化能力，维持整个造血系统的细胞群体组成与功能。内皮-造血转化（endothelial-to-hematopoietic transition, EHT）是HSC重要的起源过程：在背主动脉的腹侧，部分早期动脉内皮细胞（early arterial endothelial cell, eAEC）特化为生血内皮细胞（hemogenic endothelial cells, HEC），产生造血干细胞前体（pre-HSC），进而成熟发育为长期造血干细胞（long-term hematopoietic stem cell, LT-HSC）。兰雨／刘兵／汤富酬团队合作通过单细胞转录组分析及功能实验验证，剖析了从eAEC向HSC发育的不同细胞群体，精确地描绘了HSC起源细胞动态轨迹【1，2】。然而，HSC谱系起源和命运决定是如何受到包括染色质三维结构、组蛋白修饰及转录因子的多维表观机制整合调控的，则尚未可知。

2022年1月17日，北京大学分子医学研究所及北京大学-清华大学生命科学联合中心何爱彬团队、解放军总医院第五医学中心刘兵团队、暨南大学兰雨团队在Nature Communications杂志在线发表研究论文Pre-configuring chromatin architecture with histone modifications guides hematopoietic stem cell formation in mouse embryos，从跨尺度的染色质三维结构、组蛋白修饰及造血相关转录因子RUNX1的表观调控维度，揭示了HSC起源的命运决定机制。

为了探究哺乳动物胚胎中多维表观遗传层级如何调控HSC发生这一科学问题，该研究突破了少量细胞检测的技术瓶颈，应用少量细胞sisHi-C（small-scale in situ Hi-C）技术【3】和何爱彬团队早期开发的少量细胞itChIP-seq（indexing and tagmentation-based chromatin immunoprecipitation sequencing）技术【4】，分别在数百个细胞中，检测染色质互作结构、组蛋白修饰及转录因子结合图谱。根据兰雨／刘兵／汤富酬团队前期精准鉴定的功能高度富集细胞群体的表面标志【1，2】，作者从小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区和胎肝中分别收集了HSC发育路径上相邻的四种细胞类型：eAEC、HEC、pre-HSC以及LT-HSC。结合团队近期发表的单细胞转录组数据【1，2】，以大范围到小范围的不同层级染色质空间结构发育变化为主线，进行HSC起源的多维表观遗传调控机制解析。

图1.细胞样品示意图及多维表观调控检测

促进造血发生的染色质互作变化发生在拓扑结构域（topologically associated domain, TAD）内部。在大尺度的染色质区室层级（100 Mbp），基因组被划分为转录活跃性高的A类区室和转录活跃性低的B类区室。仅有约10.78%的基因组区域存在任两个时期之间的A/B类区室互换的现象。TAD为染色质区室的下一级结构，其边界富集了H3K4me3信号，存在阻隔强度的动态变化，但并未直接影响TAD边界附近基因的表达。而进一步探究发现，TAD内部的调控元件互作及伴随的组蛋白修饰变化，直接与造血发育进程相关。

HSC特异的增强子在eAEC中已经处于一定程度的激活状态。与以往的从无到有的增强子激活认知不同的是，在EHT初期的eAEC中，造血过程相关TAD中的增强子已经显著富集激活性组蛋白修饰（H3K27ac和H3K4me1）。从eAEC经过HEC，到pre-HSC，增强子的活性信号并没有变化，仅在pre-HSC至LT-HSC这一阶段才进一步增强。这提示在eAEC中，已经初步准备好了造血发生的相关染色质修饰基础，但需要染色质互作结构及转录因子的结合，驱动促进HSC产生。

染色质互作在早期变化最显著。EHT初期（eAEC-HEC），TAD内部染色质互作大幅度变化，造血相关基因所在区域的互作显著增强。在EHT末期pre-HSC到LT-HSC转变中，TAD内互作只是小幅度增强，但标记活性增强子的组蛋白修饰H3K27ac则一定程度显著提升。整个过程中，相应的抑制性组蛋白修饰H3K27me3逐步减弱，为造血发生创造活跃染色质环境。

图2. TAD内互作强度聚类、对应的组蛋白修饰信号和调控相关生物学过程

图3. HSC发生的多维表观遗传层级调控示意图

令人意外的是发现早在eAEC时期，RUNX1蛋白已富集结合于增强子-启动子（E-P）互作的锚点区域。RUNX1 是一个重要造血发育相关转录因子【5】，一般认为它为驱动HSC的发生所必须，其表达时间与HSC一致，它的缺失会造成胚胎造血异常或致死【6，7】。受限于检测技术对细胞数目的要求，很多已有研究只能使用体外分化样品或细胞系进行RUNX1的ChIP-seq实验【8-10】，以探究RUNX1如何调控HSC细胞命运。利用新开发的高灵敏度itChIP-seq技术，该研究以100-500个分选细胞为起始样品，检测了eAEC、HEC、pre-HSC和LT-HSC的RUNX1全基因组结合图谱。研究发现，HSC发生过程中，RUNX1参与了约40.9%的E-P互作。其中，互作强度暂时或持续上升的E-P互作与造血及免疫过程显著相关。基于RUNX1结合互作的启动子及增强子区域，该研究预测出与RUNX1协同调控染色质互作的其它转录因子，如GFI1b、PU.1、IRF家族蛋白、SMAD家族蛋白等。该预测结果为RUNX1协同其它转录因子共同调控EHT的机制探究提供了指示方向。

图4. RUNX1参与增强子-启动子(E-P)互作及调控相关生物学过程

简而言之，该研究突破了体内样品细胞数目限制的技术瓶颈，整合了多层级染色质结构、不同组蛋白修饰及转录因子RUNX1的多组学数据，揭示了HSC起源的表观遗传层级调控新机制。

北京大学分子医学研究所博士李晨、军事科学院博士生张广雨为论文共同第一作者，何爱彬教授、刘兵研究员、兰雨研究员为本文的通讯作者。